FRACCIONAMIENTO CELULAR

 

Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregman

 

      El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal  de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por  el método de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el  coeficiente de sedimentación de los cloroplastos.

 

      HOMOGENIZACIÓN

 

      Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado(una solución amortiguadora, salina  ó azúcar isotónica). Para mantener  la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación , todas las soluciones y cristalería debe mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero(fig.1), al cual se le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor.

 

CENTRIFUGACION

 

      Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa(RCF)en unidades de g.  La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación : RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga.

 

      CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

                 

      En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces  a altas velocidades ,sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” contiene el núcleo, células intactas y tejido.. L próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el “pellet” nuclear, el cual es tranferido a otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial ; éste contiene mitocondria y micro cuerpos.

      Los cloroplastos de las células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal. Después que el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenado se filtra a través de una gaza para remover los pedazos grandes de tejidos. El filtrado es centrifugado a 200 g por 1 minuto. El sobrenadante se centrífuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los clorosplastos.

      La fracción nuclear y mitocondrial de las células de las células de la coliflor se obtendrán utilizando una centrifugación diferencial escrita por W.D. Bonner (1967). El tejido se homogeniza en una solución amortiguadora de mannitol. Después se la filtración a través de una gaza, el homogenado es centrifugado como se ilustra en la fig. 2, paso 3.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig.2

EXAMINACION MICROSCÓPICA

     

      Todas la s fracciones aisladas se examinarán microscópicamente para identificar los organelos presentes.

 

      Cloroplastos.  Los cloroplastos son relativamente órganelos grandes, por lo tanto, se algunos detalles internos se observan con el microscopio de luz. Luego de examinar la morfología normal de los cloroplastos de la espinaca, se estudiarán los efectos de dos compuestos orgánicos. Los cloroplastos serán tratados con una solución saturada de urea y una solución acuosa de Triton X-100, el cual es un detergente fuerte. Urea es conocida para desnaturalizar proteínas, alguna de las cuales salen de la membrana de los cloroplastos.

Núcleo.  Para la observación de los núcleos se debe realizar una tinción. El tinte a utilizar será lacto-aceto-orcein, el cual tiñe de rojo la cromatina. Cada nucleolo aparece como un área prominente, redonda y clara.

 

      Mitocondria.  Las mitocondrias son teñidas con el tinte Janus green B. Después de la tinción, la mitocondria tiñe azul-verdosa, la cual es el color del tinte en su forma oxidada; en su forma reducida, el tinte es incoloro. El Janus green se mantiene en estado oxidado por el sistema de oxidasa citocromo de la mitocondria.

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

I.                  DETERMINACIÓN DE LAS VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDAS PARA EL AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

 

1.      Mide el radio del rotor ( la distancia en centímetros desde el centro del rotor hasta el extremo inferior de un tubo de centrífuga colocado horizontalmente). Anote este dato en la tabla de la pág. 125.

2.      Calcula las rpm requeridas para cada una de las centrifugaciones (200g y 1300g) para obtener una fracción conteniendo cloroplastos, usando la fórmula RCF= 1.119 x 10-2 (rpm)26 x. Anote los datos en  la tabla de la página 125.

3.      Usando los datos obtenidos en el paso anterior ajusta el tacómetro en la centrífuga con el propósito e obtener los rpm requeridos equivalentes a 200 g  y a 1,300 g.

 

 

II.       AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

 

1.      Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las cuales se les removieron las venas centrales.

2.      Corte las hojas en pequeños pedazos y colóquelas en un mortero frío.

Añada 15 ml de la solución amortiguadora de Tris-NaCl fría y arena  purificada. Macere el tejido por 2 minutos.

3.      Filtre la suspensión a través de varias capas de gaza a un tubo de centrífuga de 15 ml frío.

4.      Centrifuge el líquido filtrado a 200 g por 1 minuto. Verifique que los tubos de centrífuga estén balanceados.

5.      Decante el sobre nadante a un tubo frío y centrifuge a 1300 g por  5 minutos.

6.      Después de la centrifugación, mida las distancias A y B (Fig. 10.3). A es la distancia en centímetros desde el extremo inferior del tubo de centrífuga al tope del “pellet”. Anote los datos en la página 125; éstos se utilizarán para calcular el Coeficiente de Sedimentación.

7.      Decante y descarte el sobre nadante y usando una probeta , añsda 10 ml de la solución amortiguadora fría de Tris-NaCl al “pellet” que quedó en el tubo de centrífuga. Resuspenda el “pellet” con una pipeta Pasteur.

8.      Tape el tubo de centrífuga, e invierta el mismo para mezclar su contenido. Colocar en hielo.

 

 

III.     OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

 

1.      Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensión de cloroplastos y lleve a cabo una preparación húmeda “wet mount”. Use una pequeña gota de modo que no tenga que ejercer presión sobre el cubreobjetos, dañando los cloroplastos.

2.      Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y luego y luego bajo el objetivo de inmersión en aceite.

3.      Mida el largo de y el ancho de 5 cloroplastos. Anote los datos en la página 12

4.      Observa la morfología de varios cloroplastos. Identifica los cloroplastos que tengan una morfología interna poco homogénea y contesta las preguntas de las página 12.

5.      En el espacio provista en la página 1, represente con un diagrama los cloroplastos que muestren detalles internos e identifique sus estructuras.

 

IV.      OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA  DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA

 

1.      Coloque una pequeña gota de la suspensión de cloroplastos en una laminilla limpia. Añada una gota de la solución de urea saturada y coloque un cubreobjetos.  Cuidado de no presionar el cubreobjetos.

2.      Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersión de aceite por  5 minutos y conteste las preguntas de la página 12

3.      Dibuje los cloroplastos que presenten una morfología alterada.

 

V.        OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE  LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON TRITON

 

1.      Prepare un montaje húmedo usando una pequeña gota de la suspensión de cloroplastos y una gota de solución de Triton X-100  al 2%.

2.      Examine la preparación bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersión de aceite y conteste las  preguntas de la página 12.

 

 

VII.    DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

 

1.      Determine el coeficiente de sedimentación para los cloroplastos que  inicialmente estaban en la parte superior de la suspensión y luego de la centrifugación se movieron al tope de l “pellet”. Para determinar S, calcule la distancias X1 y X2. Como de se demuestra en la fig. 10.3;

X1= radio del rotor- A; y X2= radio del rotor-B. Anote los valores para

       X1 y X2 en la tabla de la pág. 11.

 

2.      Anote los valores para rpm y (t2-t1) (en segundos). Calcule S usando la ecuación :

 

S=  210 log(x2/x1)

            (rpm)2 (t2-t1)

 

 

 

 

 

 

 

 

VIII.  AISLAMIENTO DE FRACCIONES CELULARES Y MITOCONDRIALES

 

1.      Remueva 20 g de la parte externa del coliflor con un escalpelo.

2.      Coloque el tejido en un mortero frío con 40 ml de medio de maceración de Mannitol (Mannitol grinding medium) y 5 g de arena purificada. Macérelos tejidos por 4 minutos.

3.      Filtre la suspensión a través de 4 capas de gaza a un tubo de centrífuga. Deje reposar el tubo por 2 minutos.

4.      Decante cuidadosamente el sobre nadante a un tubo y centrifuge a 600 g por 10 min. a  0-4° C .

5.      Decante el sobre nadante post nuclear a un tubo de centrífuga y coloque el “pellet” nuclear en un baño de hielo.

6.      Centrifuge el sobre nadante post nuclear a 10,000 g por 30 min  a

 0-4° C. Durante la centrifugación examine microscópicamente .

7.      Decante y descarte el sobre nadante post mitocondrial y añada 5 ml del medio e mannitol frío al “pellet mitocondrial”.

8.      Con una espátula remueva el “pelletmitocondrial  de las paredes del tubo de centrífuga y luego con una pipeta Pasteur, resuspéndalo en el medio de mannitol.

9.      Transfiera la suspensión mitocondrial a un tubo de ensayo y colóquelo en un baño de hielo.

 

IX.      OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION NUCLEAR

 

1.       Con una espátula remueva una pequeña cantidad del “pellet” nuclear y aplíquelo en una laminilla. Añada varias gotas del tinte para núcleo lacto-aceto-orceina. Luego de 15 seg, añada un cubreobjetos y remueva usando un poco de presión el exceso de tinte con papel toalla.

2.      Examine la preparación bajo el objetivo de alta potencia usando un filtro verde. Luego de identificar los núcleos, utilice el objetivo de inmersión en aceite. Mida sus diámetros y anótelos en el espacio provisto en la pág. 12

3.      Represente con un diagrama los núcleos observados e identifique los nucleólos.

 

X.  OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION MITOCONDRIAL

 

1.      Coloque 5 gotas de la suspensión mitocondrial en un tubo pequeño. Añada 5 gotas del tinte verde Janus (Janus green stain), agite y espere 10 minutos.

2.      Coloque una gota de la mezcla en una laminilla limpia y observe bajo el objetiva de alta potencia y el de inmersión  en aceite del microscopio. Identifique las mitocondrias.

3.      Mida el largo y ancho de 5 mitocondrias. Calcule la media de los valores. Anote los datos en la pág.12

4.      Observe la morfología de las mitocondrias y conteste las preguntas de la pág.13.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nombre:                                                                                Sección:

 

Fecha:

 

 

Ejercicios y Preguntas:

 

DETERMINACIÓN  DE VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDA PARA AISLAR CLOROPLASTOS

 

 

RCF                            Radio del Rotor(cm)                         rpm requerido

 


                        200 g

 

                        1300 g

 

 

 

AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

 

 

A=_______  cm;  B= ________ cm

 

 

 

 

DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

 

 

x1                         x2                           rpm              (t 2 -   t1 )              s                S

 

 

 

 

 

 

Compare  el valor de S para el sedimento de cloroplastos en agua pura a 20°C, es el valor obtenidos de S en el amortiguador de Tris-NaCl  un bajoestimado ó sobreesstimado? Explique

 

 

 

 

 

Observaciones y Preguntas:

 

 

EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

 

 

Largo y ancho de los cloroplastos(mm)

 

Cloroplasto                1          2            3             4          5

 

 

Largo                                                                                      X=_______(mm)

 


Ancho                                                                                     X=_______(mm)                                                    

 

           

Cuál es la forma de un cloroplasto individual ?

 

 

 

 


Qué estructuras son visibles en los cloroplastos ?

 

 

 

 

 


EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA

 

 

Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos?

 

 

 

 

 


En presencia de luz qué sabe usted de la acción de la urea, explique sus observaciones.

 

 

 

 

 


EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA

 

 

Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos?

 

 

 

En presencia de luz qué sabe usted de la acción de Triton X-100, explique sus observaciones.

 

 

 

 

 


EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LA FRACCION NUCLEAR

 

Diámetro nuclear (µm)