TRANSFORMACIÓN   BACTERIANA

(Bacterial Transformation Kit- BIO-RAD)

 

 

En este laboratorio se realizará una transformación genética. Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una proteína. Esta proteína le da a un organismo una característica particular. La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético ( DNA).  Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación  Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.

 

La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características  como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo.  En la medicina,  enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gene defectuoso que causa la enfermedad.

 

Los genes pueden ser sacados del genoma humano, animal o vegetal y puestos dentro de una bacteria.  Por ejemplo, la hormona insulina humana es producida ahora por bacterias, purificada y vendida en nuestras farmacias para el tratamiento de la diabetes ya que en los pacientes con esta enfermedad sus genes no funcionan normalmente.

 

 

 

           En este laboratorio se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP).  Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” que es fluorescente y  bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria.  La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.

 

          En esta actividad usted aprenderá el proceso de mover un gene de un organismo a otro con la ayuda de un plasmido.  Las bacteria demás de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o mas de estos).  El ADN del plasmido usualmente contiene genes para una o mas características que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria.  En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes.  En este ejercicio usted utilizara el plasmidio pGLO que contiene el gene para hacer la GFP.  Usted introducirá el pGLO a la bacteria E coli.   Osea realizará una transformación bacterial.

         

Los plasmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gene de resistencia al antibiótico ampicilina (amp).  El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.  

 

Luego de realizar la transformación se crecen las células en medio LB y en presencia de ampicilina.  La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo.  Las colonias de células transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina.  Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa.  Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

 

 

Procedimiento:

 

1.     Identifique un  micro tubo con +DNA y otro con –DNA. Anote sus iniciales. Coloque los micro tubos en el estante de foam.

 

2.   Abra los tubos y utilizando una pipeta de transferencia estéril, añada 250 µL de la solución de transformación (CaCl2).

 


3.   Coloque los tubos en hielo.

 

4.   Con un “loop” estéril tome una colonia aislada del plato que contiene el cultivo bacteriano. Colóquelo en el micro tubo rotulado +DNA, verifique que la colonia se disperse en la solución de transformación. Coloque el tubo nuevamente en el hielo. Repita este procedimiento con el tubo rotulado –DNA.

 

5.    Observe la solución del DNA pGLO bajo la luz ultravioleta. Anote sus observaciones. Sumerja un “loop” estéril en el tubo con el plasmido, observe que tenga solución y mezcle en el tubo rotulado +DNA. Cierre el tubo y coloque nuevamente en hielo. No añada el plasmido al tubo rotulado DNA.

 

6.   Incube los tubos en hielo por 10 minutos


 


7.    Mientras los tubos están en el hielo; rotule los platos de agar en la parte inferior, no como se muestra en la figura.

 

8.   Realice el choque de calor. Usando la gradilla de “foam” transfiera ambos tubos en el baño de agua ajustado a 42 °C , por exactamente 50 segundos. Asegurése que todos los tubos estén sumergidos en el agua. Cuando pase el tiempo requerido, coloque los tubos en hielo. Para mejores resultados el cambio el cambio de hielo (0°C) a 42°C  y luego colocarlo en hielo debe ser rápido. Incube los tubos en  hielo por 2 minutos.

 

9.   Remueva la gradilla que contiene los tubos del hielo. Usando una pipeta estéril, añada 250 μl del caldo LB en cada tubo y ciérrelo.  Repita lo mismo con el otro tubo  e incube ambos tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

 

10.                      Tape los tubos y mezcle. Usando una pipeta nueva, transfiera 100 μl de las suspensiones de transformación y el control.

 

11.Utilice una pipeta estéril para cada plato. Esparza  cada superficie de los platos.

 

 

12.                       Invierta los platos y  cúbralos con cinta adhesiva. Rotule con su nombre y coloque en la incubadora a 37°C  hasta el próximo día.

13.                       Favor de limpiar las mesas con lisol y recoger todo material en el carrito de la técnica.