Electroforesis en agarosa; para muestras de DNA

 

La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas

en una solución.  La electroforesis en agarosa permite separar moléculas de

DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el

polo opuesto a su carga neta.  Hay dos fuerzas de acción opuesta que

determinan la velocidad de la partícula.  Primero, la fuerza eléctrica atrae

en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente

proporcional a la carga.  Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la

migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula.

 

El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso molecular similar.  Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza

eléctrica es igual para cualquier molécula de ácido nucleico.  La diferencia

en velocidad de migración estará dada por diferencias en la fuerza de

rozamiento, o sea por la forma y tamaño de la molécula de DNA.  En el caso

del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces

las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su

tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases.

 

Para lograr una separación eficiente se utiliza un medio soporte que aumenta la fricción recibida por las macromoléculas y reduce la difusión al mínimo. Este medio un polímero orgánico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa.  Las mezclas de DNA de diferentes tamaños se hacen migrar a través del gel durante cierto tiempo y se obtiene una separación en el que

la distancia migrada por una molécula es inversamente proporcional a su

longitud en pares de bases (tamaño).

 

 

Preparación de la gelatina de agarosa

 

1.         Determinar la concentración y el volumen de gelatina que se necesita.  Si

            el DNA tiene un tamaño desconocido se debe utilizar una gelatina de    

            agarosa al 1.0% (1g/100 ml) en una plato de gelatina pequeño (30 ml).

 

2.         Preparar la gelatina al porciento deseado según se indica en el siguiente

            ejemplo.

 

Ejemplo 1:  preparar 30 ml de agarosa al 1.0% (1g/100 ml)

Hay que determinar cuanta agarosa se necesita para preparar 30 ml

(30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)

Se despeja la ecuación para la X

El resultado es 0.3 g

 

 

 

3.         Pesar la cantidad de gelatina que se necesita (ejemplo 1 = 0.3 g) y

            transferir a un frasco Erlenmeyer.

 

4.         Añadir el volumen deseado de solución amortiguadora Tris Borato EDTA

           (TBE) 0.5X (ejemplo 1 = 30 ml).

 

5.         Calentar en un horno microondas hasta que se disuelva la agarosa

             totalmente (aproximadamente 1 minuto).  Cuando la agarosa se disuelva

             completamente la solución se tornará clara.

 

6.         Enfriar la agarosa hasta 50 ºC.

 

7.         Colocar la peinilla (comb) en el plato de gelatina.

 

8.         Echar la solución de agarosa en el plato de agarosa evitando la formación

           de burbujas.  Si se forman burbujas, se pueden remover usando una punta

           (tips).

 

9.         Dejar que la gel se solidifique a temperatura ambiente (aproximadamente

            30 minutos).  La gel sólida tiene una apariencia opaca.  Para que la gel

            quede de un espesor uniforme, el plato de gelatina debe estar en una

            superficie plana que esté nivelada.

 

 

Para cargar la gelatina de agarosa

 

1.         Colocar la gelatina dentro de la cámara de correr la electroforesis.

 

2.         Añadir suficiente TBE 0.5X hasta cubrir completamente la gelatina

           (aproximadamente 0.5 cm sobre la gelatina).

 

3.         Cargar cuidadosamente ~ 10 ul de muestra por pozo utilizando una

            micropipeta.  De igual manera cargar todas las muestras deseadas.  Incluir

            en la gelatina una muestra conteniendo un marcador de peso molecular.

 

4.         Conectar el equipo de electroforesis.  Unir los electrodos positivos

            (rojos) y negativos (negros) a los terminales correspondientes.

 

5.         Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100

            voltios).  Si el equipo está funcionando bien, entonces se podrán observar

            burbujas saliendo de los electrodos.  Debe asegurarse de que las muestras

            están corriendo en la dirección correcta, hacia el electrodo positivo.

 

6.         Corre la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido

            aproximadamente entre la mitad  y tres cuartos del plato de gelatina.

 

 

 

7.         Apagar el equipo.

 

Visualizar el DNA en la gelatina con azul de metileno

 

1.         Colocar la gelatina en una solución de 0.025% azul de metileno por 30

            minutos.  La gelatina debe quedar completamente sumergida en la 

            solución.

 

2.         Desteñir la gelatina en agua destilada por 30 minutos.  La gelatina debe

            quedar completamente sumergida en la solución.

 

3.         El DNA se torna visible cuando se observa en una lámpara de luz visible.

 

4.         Fotografiar la gelatina usando una cámara Polaroid (o equivalente).