El ciclo del Nitrógeno

 

 

El nitrogenados es bien importante para los organismos vivos, ya que es parte de los ácidos nucléicos y de las proteínas.  El ciclo del nitrógeno involucra la conversión enzimática de compuestos nitrogenosos encontrados en el suelo, y del nitrógeno gaseoso de la atmósfera, en compuestos inorgánicos de nitrógeno que son utilizados por las plantas para la síntesis de estas macromoléculas.  El ciclo posee 4 fases distintas:

 

1.                  Amonificación:  Degradación secuencial de compuestos orgánicos

                        nitrogenosos como por ejemplo los aminoácidos y la liberación de 

                        ammonia.

 

2.                  Nitrificación:  Es la oxidación de ammonia a nitrito (NO2-) y luego a

                        nitrato (NO3-), una forma nutricional de nitrógeno que puede ser

                       asimilada por las plantas.

 

3.                  Denitrificación:  Reducción de nitratos no utilizados por las plantas a

                        nitrógeno gaseoso (N2).

 

4.                  Fijación de Nitrógeno: Combinación química de nitrógeno libre (N2) con

                        otros elementos para formar nitrogeno fijado (compuestos conteniendo

nitrógeno).

 

La siguiente figura resume el ciclo del nitrógeno y todos estos procesos.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Parte A: Amonificación- detección de amonia

 

Esta prueba se basa en la detección de ammonia en el medio de cultivo.   Se utilizan medio con peptona (sustrato orgánico que contiene nitrógeno).

 

Procedimiento:

 

Colección de muestras y cultivo de microorganismos:

 

Preparar tubos que contengan caldo de peptona.

Recolectar las muestras. Cultivos de Bacillus cereus, pueden ser utilizados como

controles positivos.

Utilizando una aguja de inoculación estéril, inocular cada tubo con la muestra a

investigar. Preparar un tubo para cada muestra diferente.

Incubar los tubos 7 días a 25 grados centrígrados.

 

Prueba para detectar la presencia de ammonia:

 

Hacer la prueba para detectar ammonia a los tres, cinco y siete días de inoculación.

Usando una pipeta Pasteur colocar una gota del reactivo de Nessler en una placa.  Añade una muestra del cultivo utilizando un loop de inoculación. Mezcla mediante rotación.  Determina utilizando la siguiente tabla la presencia de ammonia.

 

Color

Resultado

No cambio

0 no amonia

Amarillo pálido

1+ poca ammonia presente

Amarillo intenso

2+ moderada cantidad de amonia

Precipitado marrón

3+  gran cantidad de amonia

 

 

PARTE B: Nitrificación: detecció de nitratos y nitritos

 

Las bacterias como Nitrosomonas y Nitrobacter presentes en suelo, convierten el ammonia en nitrito y luego este en nitrato.

 

Establecimiento de Cultivos

 

Tomar las muestras de suelo y añadirlas a envases roducción caldo con sulfato 

de ammonia y caldos con nitrito.

Incubar por 3 semanas a 25 0 C.

 

Detección de nitritos en caldos con sulfato de ammonia:

 

1.      AMONIA: Determinar la presencia de ammonia utilizando el reactivo de

Nessler. (referirse a parte A).  Si no hay ammonia puede que ésta se haya 

      convertido en nitrito. 

 

2.      Mezclar 3 gotas del reactivo de Trommsdorf con una gota de ácido sulfúrico

roducc y una muestra del cultivo de suelo.  Observar cambio en color.  La    

                  presencia de un color azul-negro indica presencia de nitrito.  Si no hay cambio 

                  en color entonces es un resultado negativo.

 

Producción de nitrato en cultivos preparados en caldos con nitrito;

 

1.                  Repetir el paso 2 para determinar la presencia de nitrito.  Cotejar si hay

                        nitrato SOLO si NO hay nitritos, ya que la prueba de nitrato daría positivo

                        en la presencia de ambos nitrito y nitrato.

2.                  Determinar la presencia o ausencia de nitrato con una gota de difenilamina

                        y dos gotas de H2SO4 concentrado.  Añadir una gota del cultivo de suelo.

 

 

PARTE C: Denitrificación-detección de nitrógeno gaseoso

 

            Esta prueba detecta la producción de nitrógeno gaseoso.

 

Cultivos:

 

Preparar tubos con caldo con nitrato conteniendo tubos Durham (pequeños tubos 

que atrapan gas producido en el cultivo).

Inocular los tubos con la muestra de suelo. Utilizar técnicas asépticas.  No ajitar   los tubos.

Incubar los cultivos durante 2 semanas a 25 0 C.

 

La presencia de gas en los tubos Durham indica que hubo denitrificación.

 

Referencias:

 

R. A. Pollack, 2002. Laboratory Exercices in Microbiology John Wiley &

sons, Inc

 

3ra edición J.G. Cappuccino y N. 

Sherman 1992. Microbiology a Laboratory Manual Benjamin/Cummings Inc.

 

A.E. Greenberg, L.S. Clesceri y A. D. Eaton Standard Methods for 

Examination of Water and Wastewater 18th edición, 1992.